膽汁酸被認為是一類重要的生物標(biāo)志物，或者被認為可在代謝性疾病的治療中發(fā)揮作用。由于膽汁酸存在多種異構(gòu)體以及檢測方法靈敏度的限制，同時進行多種膽汁酸定量分析的工作仍是一個挑戰(zhàn)。島津中國創(chuàng)新中心與北京大學(xué)第三醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)劉東陽研究員課題組合作開發(fā)一種準(zhǔn)確、靈敏的液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），以進行多種極性相近膽汁酸的同時定量檢測。通過將開發(fā)的定量分析進一步應(yīng)用于健康人群血漿樣本的測試，對其中35個膽汁酸進行定量分析，用以觀察葡萄糖攝入后血漿中膽汁酸的動態(tài)分布特征。相關(guān)成果以“Isomers-oriented separation of forty-five plasma bile acids with liquid chromatography-tandem mass spectrometry"為題，發(fā)表在化學(xué)期刊《Journal of Chromatography A》(doi.org/10.1016/j.chroma.2024.464827)

背景介紹

本研究建立了LC-MS/MS同時定量人體血漿樣品中45種膽汁酸的分析方法。該方法以異構(gòu)體分離為導(dǎo)向，使用9種穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，經(jīng)過對色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化后，可同時準(zhǔn)確定量分析45種膽汁酸的人體血漿濃度，并保證均獲得0.05-10 ng/mL的定量下限。系統(tǒng)適用性、線性相關(guān)系數(shù)、可靠性、準(zhǔn)確度和精密度等相關(guān)結(jié)果，均滿足方法學(xué)要求，本研究所建立的質(zhì)譜定量方法具有較高的靈敏度和更高的分離能力。

實驗條件：

本工作使用島津液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜LCMS-8060NX進行方法開發(fā)、驗證及實驗樣品檢測。

LC分離參數(shù)：

流動相A：水+0.01%甲酸；流動相B：乙腈+0.01%甲酸

色譜柱：ACE EXCEL 1.7 C18 (2.1mm*100mm, 1.7μm)

流速：0.25mL/min

柱溫：45℃

進樣量：3μL

質(zhì)譜檢測參數(shù)：

離子化模式：ESI，負離子模式；霧化氣：2L/min;干燥氣：10L/min; 加熱氣：10L/min; 接口溫度：300℃；

脫溶劑管線DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃。

實驗結(jié)果

圖2顯示45種目標(biāo)膽汁酸及9種內(nèi)標(biāo)的MRM離子流圖，各化合物得到良好分離，且無明顯干擾。對該方法進行方法學(xué)驗證，獲得良好的系統(tǒng)適用性、基質(zhì)效應(yīng)、殘留效應(yīng)、稀釋可靠性、準(zhǔn)確度、精密度、線性及穩(wěn)定性結(jié)果，證明分析方法的可靠性。

對進行靜脈葡萄糖耐量試驗（IVGTT）的12個健康中國志愿者在不同時間點(基線區(qū)間及攝入葡萄糖后，0-240min)采集的共180個血漿樣品進行檢測。共計35種膽汁酸被檢出，其中27種符合定量分析標(biāo)準(zhǔn)要求(在超過2/3的個體樣品中可被準(zhǔn)確定量分析)。代表性膽汁酸的濃度-時間變化曲線如圖3所示。根據(jù)檢測結(jié)果，在進行糖分攝入后，游離型膽汁酸與結(jié)合型膽汁酸顯示不同的變化規(guī)律。游離型膽汁酸濃度在整個實驗過程中持續(xù)性下降，而同時結(jié)合型膽汁酸會在起始階段先出現(xiàn)下降而后在特定時間點發(fā)生反彈，表明存在不同的因素影響兩種類型膽汁酸發(fā)生變化。

對比IVGTT過程中膽汁酸濃度-時間曲線與血糖濃度變化趨勢，圖4對比了游離型膽汁酸CDCA、結(jié)合型膽汁酸TCA以及總膽汁酸與血糖、胰島素的變化過程。在給予靜脈葡萄糖注射后，游離型膽汁酸與葡萄糖均呈現(xiàn)快速的清除速率，顯示血漿中濃度的快速下降。結(jié)合型膽汁酸在注射葡萄糖60min內(nèi)顯示與游離膽汁酸類似的變化趨勢，但是之后出現(xiàn)濃度的明顯上升。總膽汁酸的變化趨勢與游離型膽汁酸CDCA的變化趨勢更加接近。

小結(jié)：

綜上所述，本工作基于島津液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法（LC-MS/MS）建立了同時準(zhǔn)確定量生物樣本中45種膽汁酸的分析方法，并將該方法進一步應(yīng)用于檢測葡萄糖耐受實驗后健康人群血漿中膽汁酸的變化。研究結(jié)果表明，膽汁酸、葡萄糖和胰島素的變化之間存在一定的相關(guān)性，其具體機制還需進一步研究調(diào)查。